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原标题:菌体密度呈指数增加反馈补料,因此控制乙酸生

浏览次数:107 时间:2020-02-07

Escherichia coli的高密度培养大多采用分批补料技术,分批补料技术(fed-batch culture)是指在微生物分批发酵中间歇或连续补加一定物料的技术。补料的方式主要参看表1.3。其中,恒速流加是指以恒定的速率补加营养物质,在培养前期,菌体生长迅速,随着菌量的增加和代谢产物的积累,比生长速率逐渐下降,但菌体总量在发酵过程中还是线形增加的。指数流加是对变速流加的改进,根据菌体在指数生长期内菌体数目指数增加,通过微机控制,指数流加营养物质,使基质浓度保持在较低水平,有效的抑制了副产物的积累,提高了外源蛋白的表达效率。表1.3 基因工程菌Escherichia coli高密度补料分批培养流加策略Table 1.3 Fed-batch feeding strategies in HCDC for engineering E.coli非反馈补料策略

将过量的碳代谢流转化为其他低毒副产物,Aristidou[24]把Bacillus substillis的乙酰乳酸合成酶基因克隆至Escherichia coli中,此酶可催化丙酮酸转化为酸性弱且毒性对Escherichia coli来说比乙酸小50倍的物质-3-羟基丁酮,外源ALS酶的表达,大大地改变了细胞糖酵解代谢流的去向,减少了乙酸的分泌,残留的乙酸水平可控制并维持在毒性阈值之下的水平,且ALS酶的表达不会导致菌体生长速率和细胞产率任何大的改变。

目前,一些控制乙酸生成的方法正在被人们所研究,比如培养基优化法,有人以甘油代替葡萄糖作为碳源,实现了高密度培养;葡萄糖流加控制也是一种常用的控制乙酸的方法。为了减少或避免乙酸积累,已经发展了各种葡萄糖流加策略,流加方式主要有恒速流加、线性流加、指数流加等。利用代谢工程的方法改造菌种实现控制乙酸生成的手段也越来越被人们所重视。例如PTA和ACK代谢突变株的筛选。

间接反馈控制

通入纯氧改善溶氧条件。菌体有限的氧化代谢能力是产生乙酸的一个原因。在培养早期,细胞浓度较低,流加葡萄糖速率也较低,菌体能够很好进行氧化代谢;随着细胞浓度增大,葡萄糖流加速率加快,氧消耗同时也增加,当反应器供氧能力成为氧化代谢的瓶颈时,乙酸迅速积累。通入纯氧改善溶氧条件,防止氧限制是高密度培养降低乙酸积累的常使用的手段。

增加溶氧的方法有:①在通气中掺入纯氧或富氧,使氧分压提高;②提高罐压,这固然能增加溶氧,但同时也会增的浓度,因为它在水中的溶解度比氧高30倍。这会影响pH和菌的生理代谢,还会增加对设备强度的要求;③改变通气速率,其作用是增加液体中夹持气体体积的平均成分;在通气量较小的情况下增加空气流量,DO提高的效果显著。但在流量较大的情况下再提高空气流速,对氧溶解度的提高不明显,反而会使泡沫大量增加,导致逃液。④提高设备的供氧能力(以氧的体积传质系数KLa表示),从改善搅拌考虑,更容易收效。改变搅拌器直径或转速可增加功率输出,从而提高a值。另外改变挡板的数目和位置,使剪切发生变化也能影响a值。在考查设备各项工程参数和工艺条件对菌的生长和产物形成的影响时,同时测定改条件下的DO参数对判断氧的供需是大有好处的。

直接反馈控制

筛选出不产乙酸菌株或耐乙酸菌株。乙酸生成主要是由PTA和ACK两酶催化产生的,切断乙酸生成途径很可能获得产乙酸减少的突变株。1977年Brown[22]等首次报道利用氟乙酸筛选到E.coli的PTA或ACK突变株,其中PTA突变株产乙酸很少,而ACK突变株产乙酸与出发菌相当。张惟材等[23]用相同方法筛选的PTA突变株乙酸生成减少80%,但最大比生长速率降低了1/3,摇瓶培养肿瘤坏死因子表达量提高25%,发酵罐中提高3倍多,高达2.84g/L,但在后期乙酸积累也达70.3mmol/L,其它副产物乳酸、琥珀酸、丙酮酸积累更严重,分别达11g/L、25g/L、 4.8g/L。

增强供氧能力溶氧是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中受很多方面因素的限制,而DO往往是最易成为控制因素。这是氧在水中的溶解度很低所致。在28℃氧在发酵液中的100%的空气饱和浓度只有7mg/L,比糖的溶解度小7000倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100%空气饱和度,若此时中止供氧,发酵液中的DO可在几分钟之内便耗竭,使DO成为限制因素。在工业生产中产率是否受氧的限制,单凭通气量的大小是难于确定的。因为DO的高低不仅取决于供氧,通气搅拌等,还取决于需氧状况。故了解溶氧是否够的最简便又有效的办法是就地监测发酵液中的溶氧浓度。从DO变化情况可以了解氧的供需规律及其对生长和产物合成的影响。生长过程中从培养液中的溶氧浓度的变化可以反映菌的生理生长状况。随菌种的活力和接种量以及培养基的不同,DO在培养初期开始明显下降的时间不同。一般在接种后1-5h内,这也取决于供氧状况。通常,在对数生长期DO明显下降,从其下降的速率可估计菌的大致生长情况。DO低谷到来的迟早与低谷时的DO水平随工艺和设备条件而异。二次生长时DO往往会从低谷处上升,到一定高度后又开始下降——这是利用第二种基质的表现。生长衰退或自溶时会出现DO逐渐上升的规律。值得注意的是,在培养过程中并不是维持DO越高越好。即使是专性好气菌,过高的DO对生长可能不利。氧的有害作用是通过形成O,超氧化物基O2-和过氧化物基O22-,或羟基自由基OH-,破坏许多细胞组分体现的。有些带巯基的酶对高浓度的氧敏感,好气微生物曾发展一些机制,如形成触酶,过氧化物酶和超氧化歧化酶,使其免遭氧的摧毁。次级代谢产物为目标函数时,控制生长不使过量是必要的。

核心提示:Escherichia coli的高密度培养大多采用分批补料技术,分批补料技术(fed-batch culture)是指在微生物分批发酵中间歇或连续补加

加拿大pc28,通过改造葡萄糖的转运系统,减少对葡萄糖的亲和能力。

添加复合氮源菌体生长至高密度时,营养成分逐步耗尽。营养的缺乏也是限制高密度培养下实现高表达的因素。Shimizu等发现在表达阶段,限制蛋白胨和酵母抽提物的浓度,对外源基因表达不利,补料液中加大酵母抽提物比例可以提高外源蛋白的表达量。认为有机氮源提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质,减轻了细胞代谢负担,促进了外源蛋白的表达。

恒速补料 预先设定的恒定的营养流加速率,细菌的比生长速率逐渐下降,菌体密度呈线性增加变速补料 在培养过程中流加速率不断增加(剃度、阶段、线性等),细菌比生长速率在不断改变指数补料 流加速度呈指数增加,比生长速率为恒定值,菌体密度呈指数增加反馈补料

控制优化培养中pH值。当培养液pH变低时分子态乙酸比例增加,对细胞生长和外源基因表达的抑制加剧。适当提高培养时pH有助于减轻抑制。pH也会影响E. coli乙酸分泌量,Kleman等通过计算机控制系统维持葡萄糖浓度0.5g /L,高密度培养E. coli W3100,发现维持pH 6.0和6.5时,积累乙酸为6g/L,而在7.5时高达12g/L。培养时pH的变化,将导致Escherichia coli细胞生理发生变化,基因和蛋白表达也不同从而表现出不同的代谢特性。培养Escherichia coli表达外源基因时,由于不同菌株及目标产物之间存在差异性,需探索合适的pH范围,通过pH改变能一定程度上减少乙酸生成,提高外源蛋白表达效率。

核心提示:重组Escherichia coli的高密度培养的目的在于获得更高的目标蛋白单位体积产量。但是在重组Escherichia coli的高密度培养过程中,

pH-stat值法通过pH的变化,调节流加葡萄糖速度,节pH为恒定值DO-stat法 控制溶解氧、搅拌转速及补料速度,维持恒定的溶解氧,减少有机酸的生成菌体浓度反馈通过检测菌体的浓度,拟合营养的利用情况,调整碳源的加入量CO2释放速率法 通过检测CO2的释放率,估计碳源的利用情况,控制流加

有机氮源如酵母提取物以及添加苏氨酸和异亮氨酸和甘氨酸、蛋氨酸。

优化诱导条件及诱导方法在重组Escherichia coli高密度培养过程中,要达到重组产物的最大比生产率,还要考虑合适的诱导时间、诱导剂强度、诱导时的温度、诱导的培养基以及营养物的流加策略。

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