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原标题:coli的高密度培养的目的在于获得更高的目标蛋白

浏览次数:80 时间:2020-02-07

核心提示:乙酸是Escherichia coli生长繁殖过程中主要代谢副产物,尤其在高密度培养过程中,大量的乙酸产生,抑制了菌体的生长和外源蛋白的表

核心提示:我们从乙酸生成机制分析可知,乙酸的生成主要是有限的氧化代谢能力不能满足过多的碳源进行有氧代谢。因此控制乙酸生成的

核心提示:重组Escherichia coli的高密度培养的目的在于获得更高的目标蛋白单位体积产量。但是在重组Escherichia coli的高密度培养过程中,

乙酸是Escherichia coli生长繁殖过程中主要代谢副产物,尤其在高密度培养过程中,大量的乙酸产生,抑制了菌体的生长和外源蛋白的表达。

加拿大pc28,我们从乙酸生成机制分析可知,乙酸的生成主要是有限的氧化代谢能力不能满足过多的碳源进行有氧代谢。因此控制乙酸生成的策略有以下:

重组Escherichia coli的高密度培养的目的在于获得更高的目标蛋白单位体积产量。但是在重组Escherichia coli的高密度培养过程中,常常遇见的是高密度低表达现象,表达效率只有摇瓶的三分之一。实现外源蛋白在菌体高密度培养过程中高效率表达仍是工程重组菌发酵的研究热点。

对于生成乙酸机制,主要有四种推断:

通过代谢工程手段来改造菌体

高密度培养下提高外源基因表达的策略

乙酸的生成与有限的呼吸能力相关;Reiling等人发现,细胞氧吸收速率在某一个细胞比生长速率下达到最大值,当细胞比生长速率继续增大时,氧比摄取速率恒定不变。过多的葡萄糖不能被通过氧化途径彻底氧化而转而生成乙酸产生ATP和NADH2。

相关方法包括:

添加复合氮源菌体生长至高密度时,营养成分逐步耗尽。营养的缺乏也是限制高密度培养下实现高表达的因素。Shimizu等发现在表达阶段,限制蛋白胨和酵母抽提物的浓度,对外源基因表达不利,补料液中加大酵母抽提物比例可以提高外源蛋白的表达量。认为有机氮源提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质,减轻了细胞代谢负担,促进了外源蛋白的表达。

过多的NADH2促使碳流向乙酸形成代谢。在高比生长速率或高葡萄糖浓度条件下,将抑制细胞TCA循环和电子传递系统的酶活性,而导致细胞内出现高浓度NADH积累,从而使碳流迁移到乙酸形成途径。

通过基因工程手段来改造提高菌体本身氧化代谢能力,减少NADH2的积累,避免碳源代谢迁移到乙酸生成途径。

利用代谢工程方法消除乙酸的抑制作用乙酸对菌体生长和外源蛋白表达抑制的机理通常认为是乙酸破坏了跨膜质子梯度,而跨膜质子梯度是氧化磷酸化和其它需能跨膜运输所必需。pH为中性时乙酸以HAc和Ac-形式共存,Hac渗透过细胞膜,在细胞内再分解为H+和Ac-。由于不断渗透使胞外HAc和Ac-之间平衡向Hac移动,结果引起一个净电中性H+内流,降低了胞内pH。由于具有缓冲功能的培养基体积大,乙酸渗透不会导致胞外pH发生剧烈变化,因此胞内pH降低将产生去偶联影响。细胞自身的稳态机制需要能量以改变胞内pH降低趋势,即使质子推动力不发生变化情况下也是如此。因此为了快速生长,E.coli不仅需要一个大的质子电动势,而且需要维持最佳胞内pH。乙酸大量积累将加剧代谢去偶联的发生。也有报道认为乙酸等短链脂肪酸对DNA、RNA、蛋白质、脂质和肽聚糖等的合成均有抑制,而这些大分子物质是菌体生长和外源蛋白表达所必需的。

乙酸形成与TCA循环代谢能力和呼吸链电子传递能力有关。Majewski等认为有限的TCA循环能力和呼吸能力容易引起乙酸的形成。

筛选出不产乙酸菌株或耐乙酸菌株。乙酸生成主要是由PTA和ACK两酶催化产生的,切断乙酸生成途径很可能获得产乙酸减少的突变株。1977年Brown[22]等首次报道利用氟乙酸筛选到E.coli的PTA或ACK突变株,其中PTA突变株产乙酸很少,而ACK突变株产乙酸与出发菌相当。张惟材等[23]用相同方法筛选的PTA突变株乙酸生成减少80%,但最大比生长速率降低了1/3,摇瓶培养肿瘤坏死因子表达量提高25%,发酵罐中提高3倍多,高达2.84g/L,但在后期乙酸积累也达70.3mmol/L,其它副产物乳酸、琥珀酸、丙酮酸积累更严重,分别达11g/L、25g/L、 4.8g/L。

目前,一些控制乙酸生成的方法正在被人们所研究,比如培养基优化法,有人以甘油代替葡萄糖作为碳源,实现了高密度培养;葡萄糖流加控制也是一种常用的控制乙酸的方法。为了减少或避免乙酸积累,已经发展了各种葡萄糖流加策略,流加方式主要有恒速流加、线性流加、指数流加等。利用代谢工程的方法改造菌种实现控制乙酸生成的手段也越来越被人们所重视。例如PTA和ACK代谢突变株的筛选。

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