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原标题:宝马7系Nase缓蚀剂要在首先链合成反应中,又能扩

浏览次数:100 时间:2020-01-30

核心提示:摘要RT-PCR 已经成为研究者确定感兴趣的器官、组织或细胞中mRNA 转录本出现、结构和表达水平的基本方法。RT-PCR的基本步骤包

核心提示:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物?参考见解:1、 RNA被降解:在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA;使用良好的

核心提示:一、增加反应体系的灵敏度:1. 分离高质量RNA: 成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含

摘要

在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物?参考见解:1、 RNA被降解:在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA;使用良好的无污染技术分离RNA;在将组织从动物体取出后立刻处理;在100%甲酰胺中储存 RNA如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT;2、 RNA中包含逆转录抑制剂:过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25μg到0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复;逆转录抑制剂包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,亚精胺,甲酰胺和胍盐;将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂;3、 多糖同RNA共沉淀:使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖;4、 用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火:确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟;对于基因特异性引物,可以试一下其他GSP,或换用oligo或随机六聚体确定GSP是反义序列;5、 起始RNA量不够:增加RNA量;对于<50ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA;6、 RNA模板二级结构太多:将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火;提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对 ThermoScript可以到65℃。注意:不要在>60℃时使用oligo引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP;对于>1kb的RT- PCR产物,保持反应温度≤65℃。注意:不要在高于37℃时使用M-MLV;如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物;7、 引物或模板对残余的RNA模板敏感:在PCR前用RNaseH处理。8、 靶序列在分析的组织中不表达:尝试其他靶序列或组织。9、 PCR没有起作用:对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物;10、 PCR引物设计较差:避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。11、 富含GC的模板:于GC含量>50%的模板,使用PCRx Enhancer Solution。12、 镁离子浓度太低:从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意:对实时定量PCR,使用3mM到5mM的镁离子浓度。13、 退火温度太高:使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。

一、增加反应体系的灵敏度:

RT-PCR 已经成为研究者确定感兴趣的器官、组织或细胞中mRNA 转录本出现、结构和表达水平的基本方法。RT-PCR的基本步骤包括:首先对样品中出现的所有mRNA 合成一个cDNA拷贝,接着扩增感兴趣的基因。因为两个步骤中使用的反应缓冲液不能兼容,所以这两个步骤通常分别进行。即使有些试剂盒能将两个步骤合而为一,但是同样因为上述的缓冲液不兼容性,极大地限制了检测灵敏度。Eppendorf 设计了一个含有全新化学物质的新试剂盒,使一步法RT-PCR 更加有效,在两步法实验中可以获得更高的灵敏度。本文将对新试剂盒的表现进行检验。简介

在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带?参考见解:1、 引物和模板非特异性退火:在第一链合成中使用GSP,而不是随机引物或oligo。试用允许高温cDNA合成的GSP。2、 GSP设计较差:遵循用于扩增引物设计的同样原则。3、 RNA中沾染了基因组DNA:使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。4、 形成引物二聚体:设计在3'端没有互补序列的引物。5、 引物和模板非特异性退火:以2℃到5℃间隔增加退火温度,减少退火时间;在开始几个循环使用较高的退火温度,然后使用较低的退火温度;使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR;避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。6、 镁离子浓度太高 :对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。7、 因为扩增复杂模板导致引物错误起始:使用巢式PCR或递减PCR。 8、 沾染外源DNA:使用抗气雾剂的吸头和UDG。9、 因为二级结构导致引物结合位点无法接近:对于GC含量>50%的模板,使用PCRx Enhancer Solution。

  1. 分离高质量RNA:

逆转录以及随后进行的PCR是RNA 分析中使用得最广泛的技术之一。如果需要平行分析多个RNA 样品,首选方法为一步法RT-PCR。如果要扩增困难目标片段或从单一cDNA 池中扩增多重目标片段则会选择两步法。Eppendorf 推出的全新的cMaster RTplusPCR 系统适用于各种RT-PCR 应用。它含有一种全新的重组逆转录酶和一种具有高保真性的PCR 酶混合物。另外,RTplusPCR反应缓冲液能够自动调节镁离子浓度,因此这一重要成分的浓度无需优化。这种自我调节的效果是通过对镁离子的弱螯合作用来实现的。如果镁离子浓度过高,螯合剂会与过剩的镁离子结合,如果反应需要镁离子,镁离子就会被释放出来。这种创新技术提高了cMaster RTplusPCR的灵敏度和特异性。使cMaster RTplusPCR试剂盒既能进行一步法,又能进行两步法RT-PCR,而且具有很大的动力学检测范围,能扩增得到的PCR产物长度范围也很大(一步法反应最长可扩增5.3 kb片段;两步法方案最长能扩增12.3 kb 片段)。下面的实验可以展示该试剂盒在不同应用中的表现。实验1关注新试剂盒在一步法RT-PCR 中卓越的灵敏度。而在一步法应用中,最重要的因素就是能够采用尽可能少的目标材料进行有效工作。实验2显示应用一步法方案进行长距离RT-PCR 不再是个难题。试剂盒中创新的缓冲液能同时保证逆转录酶和高保真酶混合物都具有最佳延伸性。本系统提供的两步法RT-PCR 备选程序适用的模板范围很广。实验3描述了对不同模板的扩增情况。这个新的系统能为所有的RT目标提供全面解决方案,不论需要扩增的片段是中等长度还是极长,不同来源的总RNA 中转录本是低丰度还是高丰度。

定量RT-PCR无扩增产量相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照?参考见解:1、 无cDNA合成。2、 cDNA合成温度太高:降低保温温度。 3、 反转录cDNA产物被二级结构封闭:提高保温温度。重新设计引物。4、 RNA被损害或降解:必要的话更换RNA。5、 RNAse污染:维持无菌条件;加入RNase抑制剂。6、 荧光探针无功能:确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。必要的话设计和合成探针。

成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂,如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到 cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍/酸性酚的一步法。为了防止痕量RNase的污染,从富含RNase的样品中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了,而从大鼠脾脏中提取的RNA,在水中保存3年仍保持稳定。另外,长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性,可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时,可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇,室温放置3-5分钟,10,000×g离心5分钟。

材料和方法

灵敏度低,须在比预期更高的循环中检出产物?参考见解:1、 初始模板RNA不充分:增加模板RNA的浓度;使用10ng-1?g的总RNA。2、 RNA被损害和降解:必要的话更换RNA。3、 RNAse污染:维持无菌条件;加入RNase抑制剂。4、 无效的cDNA:通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂。5、 无效的PCR扩增:注意:反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。调整cDNA合成温度或引物设计。

  1. 使用无RNaseH活性的逆转录酶:

Eppendorf cMaster RTplusPCR系统Eppendorf Perfect RNA Eukaryotic试剂盒所有的PCR反应均在Eppendorf Mastercycler® gradient梯度PCR仪上进行。

信号高于预期,在低于预期的循环中即可检出产物?参考见解:1、 反应中加的样品太多:降低模板的浓度。2、 模板或PCR残余污染:隔离污染来源,更换试剂,使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应,使用抗气溶胶的吸头。

在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中,在缓冲液和还原剂存在的条件下加入,因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性,从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A,B,C对RNA的降解,并不能防止皮肤上的RNase,因此尽管使用了这些抑制剂,也要小心不要从手指上引入RNase。

实验1:一步法灵敏度检测RT-PCR 扩增目标:500 bp 的人α微管蛋白mRNA 片段。模板RNA:从人HELA细胞中纯化的总RNA。反应中应用的模板浓度从1μg递减至10pg。方案:Eppendorf cMaster RTplusPCR系统,标准一步法RT-PCR方案。1:10 稀释RTplusPCR 缓冲液,镁离子终浓度2.5 mM,反应总体积50μl循环参数:

是否RNA不用反转录,而直接PCR克隆出新基因?参考见解:PCR的底物是DNA,一定要反转录才行的。可以将rt和pcr连续进行,主要是在同一个反映管加入taq和rt酶,逆转录完成后用高温 将rt酶灭活,然后再进行pcr.但是直接进行pcr是不可以的,其实rt酶也有一定的dna聚合活性,只是比较低而已。

加拿大pc28,逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-MLV还是AMV,在本身的聚合酶活性之外,都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链,并降解RNA:DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物,降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。

循环

做大鼠PEDF的rt-PCR,Pubmed 上genebank中关于此物质的核酸序列太多,请问应怎样选择?有何选择原则?参考建议:建议将它们翻译成蛋白后进行比对,寻找保守序列,由此设计引物。或者查阅一下文献,看看该蛋白的保守domain,设计引物。其实登陆到 genebank中的该基因序列应该是一致的,你找几个比较一下可以发现。但其前后还有些其它序列,每个人登陆上去的那些序列可能不尽一致,你可以不管。不过不是所有genebank中的基因序列都百分之百的正确!一般情况下序列号是NM、AC或BC的比较可信,其中NM的可信度最好,据说该种序列是经过校正的。

SuperScriptⅡ逆转录酶,RNaseH- 的MMLV逆转录酶及ThermoScript逆转录酶,RNaseH- 的 AMV,比MMLV和AMV得到更多量和更多全长的cDNA。RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。ThermoScript比AMV的灵敏性强得多。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力,尤其是克隆较大的cDNA时。同MMLV相比,SuperScripⅡ显著提高了长 RT-PCR产物的产量。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性,所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。在建议的合成条件下,使用oligo引物和10μCi的 [α-P]dCTP。第一链的总产量使用TCA沉淀法计算。全长cDNA使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析。

步骤

怎样检测RT-PCR 模板是否降解?电泳还是分光光度计?能看出来吗?模板的浓度不是很低吗?参考见解:RT-PCR的模板,如果是一步法,那模板是RNA,检测模板质量的方法就是检测RNA质量的方法,主要的就是电泳看28S 18S和5S的亮度比;以及通过测OD260/280的比值来判断。如果用的是两步法,那模板就是cDNA一链,因为cDNA一链本身是smear,检测其质量只能通过电泳看smear的范围大小大概估计cDNA的质量。

  1. 提高逆转录保温温度:

温度

RT-PCR 与Realtime 有什么区别?参考见解:RT-PCR是逆转录PCR,但单独提及时,Real-time PCR 也可简称为RT-PCR,如果其中包含逆转录步骤,就称为RT Real-time PCR。

较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开,增加了反应的产量。对于多数RNA模板,在没有缓冲液或盐的条件下,将RNA和引物在65℃保温,然后迅速置于冰上冷却,可以消除大多数二级结构,从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构,即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用 ThermoScript逆转录酶,并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增。较高的保温温度也可以增加特异性,尤其是当使用基因特异性引物进行cDNA合成时。如果使用GSP,确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60℃时使用oligo和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外,还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度,并加入预热的2×的反应混合物提高特异性(cDNA热启动合成)。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化 RT-PCR所需的多种温度切换。

时间

为什么dNTp在反复冻融的情况下容易失效,其中的分子机理是怎样的?还有没有其它容易导致dntp失效的原因?参考见解:脱氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP 和dTTP),dNDP+ATP=dNTP+DP,这里的ATP和dNTP都是高能磷酸化合物,反复的冻溶,肯定会导致结构的不稳定。有资料表明,三磷酸核苷贮存在含镁离子的溶液中会促使三磷酸降解,既如果和有Mgcl2的污染,会加快dNTP的失活。dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为 50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等,如其中任何一种浓度不同于其它几种时,就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。

Tth热稳定聚合酶在Mg2+存在条件下作为DNA聚合酶,在Mn2+存在条件下作为RNA聚合酶。它可以在最高65℃条件下保温。然而,PCR过程中Mn2+的存在会降低忠实性,这使得Tth 聚合酶不太适合用于高精确度的扩增,如cDNA的克隆。另外,Tth的逆转录效率较低,这会降低灵敏度,而且,既然单个酶就可以进行逆转录和PCR,那么没有逆转录的对照反应就不能用来将cDNA的扩增产物同污染的基因组DNA的扩增产物区分开来。

描述

RNA中包含逆转录抑制剂怎么去除?参考见解:通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25μg到0.4μg/μl)以帮助小量样品 RNA的恢复。逆转录抑制剂包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,亚精胺,甲酰胺和胍盐。将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。

  1. 促进逆转录的添加剂:

1x

多糖同RNA共沉淀,怎么处理才能除去多糖?参考见解:使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。

包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中,可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构,最多可以加入20%的甘油或10%的DMSO而不影响SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。为了在SuperScriptⅡ逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度,可以加入10%的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中,那甘油在扩增反应中的浓度为0.4%,这不足以抑制PCR。

1

用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火 ?参考见解:确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。对于基因特异性引物,可以试一下其他GSP,或换用oligo或随机六聚体确定GSP是反义序列。

  1. RNaseH处理:

50°C

起始RNA量不够,为保证试验有什么处理方法?参考见解:增加RNA量。对于<50ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。

在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板,据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合,在这种情况下,RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时,RNaseH处理是必需的,比如低拷贝的tuberous scherosisⅡ。对这种困难模板,RNaseH的处理加强了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应,RNaseH处理是可选的,因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNA:DNA复合物中的RNA水解掉。

30分钟

RNA模板二级结构太多 ?参考见解:1.将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火。2.提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃。注意:不要在>60℃时使用oligo引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP。3.对于>1kb的RT-PCR产物,保持反应温度≤65℃。注意:不要在高于37℃时使用M-MLV。如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。

  1. 小量RNA检测方法的提高:

逆转录

引物或模板对残余的RNA模板敏感 ?参考见解:在PCR前用RNaseH处理。

当仅有小量RNA时,RT-PCR尤其具有挑战性。在RNA分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入Trizol的同时加入无RNase的糖元。糖元是水溶性的,可以同RNA保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品,无RNase糖元的建议浓度为250μg/ml。

1x

电泳后出现意外的条带 RNA?参考见解:1.被基因组DNA污染: 用DNase I预处理RNA .2.用于第一链合成的寡聚dT或随机引物 使用基因特异性引物 .3.PCR的低特异性 优化PCR条件.

在使用SuperScriptⅡ的逆转录反应中加入乙酰化BSA可以增加灵敏度,而且对于小量RNA,减少SuperScriptⅡ的量并加入40单位的 RnaseOut核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在RNA分离过程中使用了糖元,仍然建议在使用SuperScriptⅡ进行逆转录反应时加入 BSA或RNase抑制剂。

2

RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?参考见解:必须;在RT时,引物设计有3种方法即a:Random 9mers;b:Oligo dT-Adaptor Primer;和c:特异的下游引物。如果用a和b方法,是扩增的所有的cDNA,还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可。

二、增加RT-PCR特异性

94°C

曾经作过同一管的PCR,内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想(而且酶量、Mg2+加倍)。如何处理同一管的PCR的各成分的浓度?参考见解:在同一管中做RT,其实没有什么问题,不需要taq魅加量,taq酶本来就是过量的,(平时做pcr的时候,完全可以再省一些taq酶的, Mg就更不能变了,一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。 关键是摸,摸上3、5摸总是必要的,首先遥分开摸,然后再一起摸,直到摸的好了,还要考虑比较的不同的模板中的量,所以不建议在同一管中进行,因为还有互相竞争抑制的问题,即使不同基因之间。

  1. CNDA合成:

3分钟

内参可不可以不作?参考见解:一定要做内参的,每一次不作内参的结果是不可信的。电泳可以不一起跑,没有关系,计算的是相对表达程度。半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量,不是绝对表达量,除非能准确来自多少细胞,但是细胞还有死的呢。以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的,作为实验的粗筛是可以的,但不能作为最终结果的。半定量RT-PCR应该再两管中进行,除非内参基因和目的基因表达相同,长度差不多,GC含量相似。

第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法,各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。

初始变性

有的protocal上要加DTT,作用是什么?参考见解:DTT是还原剂,可延缓蛋白质的氧化,尤其保护酶中的不饱和二硫键,从而防止延缓酶的失活。一般来讲,酶的缓冲液中都或多或少地含有DTT 。

随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火,产生短的,部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA,需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA,所以模板一般选用 poly+RNA。

40x {

Oligo起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3'端所发现的poly尾杂交。因为poly+RNA大概占总RNA的1%到2%,所以与使用随机引物相比,cDNA 的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性,oligo一般不需要对RNA和引物的比例及poly+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo。oligo12-18适用于多数RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo20,因为其热稳定性较好,适用于较高的保温温度。

3

基因特异性引物对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷,可以特异性地同RNA目的序列杂交,而不象随机引物或 oligo那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA3'最末端退火的扩增引物序列相同,或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象,为了成功进行RT-PCR,需要设计多于一个反义引物,因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。建议在20μl的第一链合成反应体系中使用1pmol反义GSP。

94°C

  1. 提高逆转录保温温度:

15秒

为了充分利用GSP特异性的全部优点,应该使用有较高热稳定性的逆转录酶。热稳定逆转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性。比如,如果一个GSP退火温度为55℃,那么如果使用AMV或M-MLV在低严谨性的37℃进行逆转录,GSP所带有的特异性就没有完全利用。然而SuperScripⅡ和 ThermoScript可以在50℃或更高进行反应,这就会消除较低温度时产生的非特异性产物。为获得最大的特异性,可以将RNA/引物混合物直接从 65℃变性温度转移到逆转录保温温度,并加入预热的2×反应混合液(cDNA合成热启动)。这有助于防止低温时分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化 RT-PCR所需的多种温度转换。

模版变性

  1. 减少基因组DNA污染:

4

RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的RNA分离方法,如Trizol Reagent,会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。为了避免产生于基因组DNA的产物,可以在逆转录之前使用扩增级的DNaseⅠ对RNA进行处理以除去沾染的DNA。将样品在2.0mM EDTA中65℃保温10分钟以终止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合镁离子,防止高温时所发生的依赖于镁离子的RNA水解。

68°C

为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开,可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cDNA的PCR产物会比来源于沾染的基因组DNA 的产物短。另外对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照实验,以确定一个给定片段是来自基因组DNA还是cDNA。在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。

45秒

引物退火/延伸

cMaster RTplusPCR 系统显示出一种依赖于模板RNA 量的宽广的产物产量动力学范围。能从低至10 pg 的HELA 总RNA中检测到α微管蛋白mRNA。

实验2:一步法扩增长片段RT-PCR

扩增目标:5.3 kb 的人结节性脑硬化因子mRNA 片段。模板RNA:从人HELA 细胞中纯化的总RNA。反应中应用的模板浓度为100 ng 和10 ng。方案:Eppendorf cMaster RTplusPCR 试剂盒,针对长模板的特殊RT-PCR 方案。

设置一步法RT-PCR 反应。

成分 50μl RT-PCR反应体积 反应成分的终浓度
不含RNA 酶的水 2.5μl
dNTP 混合物每种dNTP 浓度均为10 mM 2.5μl 500μM
hTSF正向引物 1.0μl 200 nM
hTSF反向引物 1.0μl 200 nM
总HELA RNA 3.0μl 每个反应中中含10ng-100ng
MasterMix 1 10.0μl
不含RNA 酶的水 34.0μl
含镁离子的RTplusPCR 反应缓冲液 5.0μl 1×;2.5 mM 镁离子
cMaster RT 酶 0.5μl 0.15U /μl
cMaster PCR 酶混合物 0.5μl 0.05U /μl
MasterMix 2 40.0μl

循环程序参数

循环

步骤

温度

时间

描述

1x

1

65°C

5分钟

初始RNA变性

1x

2

42°C

60分钟

逆转录

1x

3

93°C

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