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原标题:使得较大的质粒的定点突变也一样简单,并比较

浏览次数:54 时间:2020-01-30

核心提示: 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具,也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具,也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能,二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构,对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系,探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因,相信大家也非常熟悉:比如野生型的绿色荧光蛋白是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光,经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造,现在的GFP能在可见光的波长范围被激发,而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNA作用元件,提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构,以及药物研发、基因治疗等等方面。

核心提示:1、 PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体,并比较研究FALL-39及其突变肽的功能.方法:应用RT-PCR从人肺腺上皮细胞株S

对于单点突变,Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择,通过巧妙设计,将质粒定点突变技术变得简单有效。准备突变的质粒必须是从常规E.coli中经纯化试剂盒或者氯化铯纯化抽提的质粒。设计一对包含突变位点的引物,和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”,正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物,由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌,是经dam甲基化修饰的,对DpnI敏感而被切碎(DpnI识别序列为甲基化的GATC,GATC在几乎各种质粒中都会出现,而且不止一次),而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开,因此在随后的转化中得以成功转化,即可得到突变质粒的克隆。这个试剂盒非常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而合成的突变质粒对DpnI酶切不敏感,利用酶切除去模版质粒,得到突变质粒,使得操作简单有效。另外由于Pfu聚合酶是公认的最好的高保真聚合酶之一,堪称高保真聚合酶的“黄金标准”,是Stratagene的看家之宝,能够有效避免延伸过程中不需要的错配。试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR,有助于减少无意错配。只需要一次酶切和转化,实验可以在一天完成。这个试剂盒适用于质粒大小不超过8Kb的质粒。后来推出的QuikChange XL site-directed mutagenesis kit则是针对大于8Kb的质粒的定点突变的,通过优化试剂特别是其感受态细胞(XL10-Gold),使得较大的质粒的定点突变也一样简单。QuikChange由于操作简单快速,效率高而受到普遍欢迎,光是今年的前9个月就有超过400篇发表的论文中用到这个产品。

1、 PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体,并比较研究FALL-39及其突变肽的功能.

定点突变的比较有特色的产品还有Clontech公司的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit,需要根据准备突变的质粒自行设计两条引物(同一方向,对同一单链模版),一条包含计划定点突变的序列,另一条引物包含质粒上某一个单酶切位点,不过在单酶切位点中引入突变,这样两条引物除了所包含的突变位点,其他序列和质粒上对应位置的序列完全一致,退火后和质粒模版结合,通过T4 DNA聚合酶延伸,延伸反应持续直到碰到另一条引物停止,两段包含突变位点的延伸产物经T4连接成环,和模版链组成杂和环,带有两处错配。单酶切反应产物,直接转化Ecoli BMH 71-18 mutS。原来的双链质粒模版被切开而不能转化,而杂和质粒由于一条链上单酶切位点引入突变而不被切开,保持环状质粒得以转化。转化子的杂和双链在E.coli的复制过程中分开,再经过一轮提质粒、单酶切、转化,最后得到纯和的突变质粒。这个试剂盒则是利用改造单酶切位点使得新合成的突变质粒不被切开从而除去原来的模版质粒。虽然这个试剂盒比上一个麻烦,但实际上是引入了两个定点突变。只不过一个用于酶切除掉模版的反应。

方法:应用RT-PCR从人肺腺上皮细胞株SPC-A-1总RNA中扩增FALL-39成熟肽cDNA,以pGEX-1λT为载体,构建抗菌肽FALL-39基因大肠杆菌表达载体;采用一步法和两步法PCR体外定点突变技术,用赖氨酸替代第24位的谷氨酰胺和/或第32位的天门冬氨酸,构建FALL-39突变体大肠杆菌表达载体;该载体表达的融合蛋白经亲合层析、凝血酶酶切、胶回收和高效液相色谱分离纯化,获得高度纯化的重组FALL-39以及突变肽;对纯化产物进行的:MEC、MIC、MBC和溶血性实验等比较抗菌作用以及对红细胞膜的溶解性,用RT-PCR测定人单核巨噬细胞株THP-1:iNOS的表达,研究FALL-39及其突变肽的抗内毒作用。

有的时候研究可能需要多个位点的定点突变,比如改造酶的活性或者动力学特性,研究蛋白之间的相互作用位点等,单点突变不能满足实验的需要,重复进行单点突变也非常浪费时间。因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。最多一次实验可以引入5个定点突变。这个试剂盒的原理和Clontech的相似,就是准备多个带突变的引物(同方向,对同一单链模版),退火后全部突变引物都结合在同一环状单链模版,PfuTurbo聚合酶延伸,碰到下一个引物就停止,各片断经连接成环,和单链模版组成杂和环,DpnI消化双链模版,也消化杂和环中的模版,只留下新合成的带多个突变的单链环(mutant ssDNA),得以转化E.coli,形成双链质粒。资料表明,引入3个定点突变的效率为60%,5个定点突变的效率为30%。得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒,以引入3个定点突变为例,就是有40% 左右的转化质粒是带有1—2个不同定点突变的质粒(因为存在1—2个引物结合模版延伸形成单链环的可能)。这样,一次实验可以得到不同数目突变的质粒,对于研究蛋白质结构和功能的关系也是有用的。

加拿大pc28,结果:重组质粒pGEX-1λT-FALL-39测序结果说明其插入片段序列与GenBank登录的FALL-39基因的cDNA序列相符,且插入方向正确;DNA测序结果表明在预期位点发生突变,用一步法得到突变体质粒pGEX-λT-FALL-39-Lys32,用两步法得到pGEX-1λT-FALL-39-Lvs24以及pGEX-λT-FALL-39-Lys24’32;重组原核表达质粒pGEX-λT-FALL-39及其突变体融合蛋白有高效表达,经提取纯化可得到高纯度的活性蛋白FALL-39,FALL-39-Lys24,FALL-39-Lys32和FALL-39-Lys24’32:突变后的FALL-39蛋白对大肠杆菌ATCC25922和耐氨苄青霉素ML-35p的抗菌活性明显增强,最低抑菌浓度和最低杀菌浓度值FALL-39-Lys24’32最小,其次是FALL-39-Lys32和FALL-39-Lys24,均小于FALL-39-FALL-39Lys32和FALL-39两种蛋白均在含:Medium E的LB培养基中表现出较高活性,在LB培养基中抗菌活性最低,但在同一种培养基中FALL-39-Lys32蛋白抗菌活性要高于FALL-39蛋白。突变后FALL-39蛋白在抗菌剂量时对红细胞的溶解作用未见明显增加,较大剂量时对红细胞的溶解作用略有增加。突变后FALL-39-Lys32蛋白对LPS引起的iNOS mRNA的表达量增强抑制作用明显。

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