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原标题:这种酶标抗原或抗体既保留其免疫性活性,它是

浏览次数:79 时间:2020-01-23

核心提示: 捕获法ELISA,主要用于血清中某种抗体亚型成分的测定。以目前最常用的IgM测定为例,因血清中针

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定用于IgG定量测定的文章,使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是:①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高,故可极大地地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。

核心提示:双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法,属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的ELISA,适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇

捕获法ELISA,主要用于血清中某种抗体亚型成分的测定。以目前最常用的IgM测定为例,因血清中针对某种抗原的特异性IgM和IgG同时存在,则后者可干扰IgM的测定。因此先将所有血清IgM(包括异性IgM和非特异性IgM)固定在固相上,在去除IgG后再测定特异性IgM。

二、方法类型和操作步骤

双抗体夹心法测抗原

工作原理设计为:先将针对IgM的第二抗体(如羊抗人IgMμ链抗体)连接于固相载体,用以结合样品中所有IgM,洗涤出去IgG等无关物质,然后加入特异抗原与待检IgM结合;再加入抗原特异的酶标抗体,最后形成固相二抗- IgM-抗原-酶标抗体复合物,加酶底物作用显色后,即可对样品中待检IgM是否存在及其含量进行测定。

ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂:①固相的抗原或抗体,②酶标记的抗原或抗体,③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。

双抗体夹心法,属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的ELISA,适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原,而不能用于小分子半抗原的检测。

操作步骤:将抗人IgM抗体连接在固相载体上,形成固相抗人IgM。洗涤。加入稀释的血清标本:保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。加入特异性抗原试剂:它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。加入针对特异性的酶标抗体:使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。加底物显色:如有颜色显示,则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在,是为阳性反应。

双抗体夹心法

其基本工作原理是:利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合,形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量,即可确定待测抗原含量。

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双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:

若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结合,则属于双位点夹心法。

图15-4双抗体夹心法测抗原示意图

若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合,则是双抗原夹心法。

将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体:洗涤除去未结合的抗体及杂质。

操作步骤: 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 加受检标本,保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。 加酶标抗体,保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色,测知标本中抗原的量。

加受检标本:使之与固相抗体接触反应一段时间,让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合,形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测。

加酶标抗体:使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

现多采用针对单一抗原决定簇特异性的单克隆抗体做固相化和酶标抗体,则受检样品和酶标抗体可一次性加入,简化流程,缩短反应时间。若标本中待测抗原浓度过高,抗原可分别与酶标抗体和固相抗体结合而不形成上述夹心复合物,使最终结果低于实际含量,甚至出现假阴性现象。因此对此类标本应适当稀释后再测定。另外,当血清中存在类风湿因子时,类风湿因子可充当抗原,而形成固相抗体-类风湿因子-酶标抗体夹心复合物,从而出现假阳性结果。

加底物:夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值与标准曲线某一抗原浓度的吸光值相同,如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。

根据同样原理,将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物,即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题。

双位点一步法

双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子的干扰。RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应。采用F或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。

在双抗体夹心法测定抗原时,如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体,则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作,缩短了反应时间,如应用高亲和力的单克隆抗体,测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

加拿大pc28,双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心。

图15-5双位点一步法示意图

双抗原夹心法用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用双抗原夹心法。双抗原夹心法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法。

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