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原标题:ELISA试剂盒实验原理,形成固相抗原-受检抗体-酶

浏览次数:71 时间:2020-01-23

核心提示: 所用的方法称为间接法,也是目前最常用的方法,其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定用于IgG定量测定的文章,使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是:①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高,故可极大地地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。

ELISA试剂盒实验原理

所用的方法称为间接法,也是目前最常用的方法,其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体,故称为间接法。

二、方法类型和操作步骤

酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)原理

此法是测定抗体最常用的方法,属非竞争结合试验。其原理是将抗原连接到固相载体上,样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物,再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合,形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物,测定加底物后的显色程度,确定待测抗体含量。

ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂:①固相的抗原或抗体,②酶标记的抗原或抗体,③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent 

间接法首先用抗原包被于固相载体,这些包被的抗原必须是可溶性的,或者至少是极微小的颗粒,经洗涤,加入含有被测抗体之标本,再经孵育洗涤后,加入酶标记抗抗体,,再经孵育洗涤后,加底物显色,底物降解的量,即为欲测抗体的量,其结果可用目测或用分光光度计定量测定,本法用不同种抗原包被固相载体后,只要用一种酶标记抗人球蛋白,即可作多种人的传染病、寄生虫病以及其他疾病的血清学诊断。如用酶标记抗人IgM,则可用于早期诊断。

双抗体夹心法

assay,ELISA)用于IgG定量测定的文章,使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成

操作步骤: 将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。 加稀释的受检血清,保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体,血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。 加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体,但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合,从而间接地标记上酶。洗涤后,固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。 加底物显色

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:

液体标本中微量物质的测定方法。

间接法由于采用的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子,因此该法只需要换固相抗原,即可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的抗体,具有更广泛的通用性。

图15-4双抗体夹心法测抗原示意图

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗

加拿大pc28 ,本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体:洗涤除去未结合的抗体及杂质。

体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定

间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果,但应尽可能予以纯化,以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质,例如以E.Coli为工程酶的重组抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质,例如来自人血浆或人体组织的抗原,如不将其中的Ig去除,试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白,也会因竟争吸附而影响包被效果。

加受检标本:使之与固相抗体接触反应一段时间,让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合,形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使

间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强,非特异IgG可直接吸附到固相载体上,有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中,抗原包被后一般用无关蛋白质再包被一次,以封闭固相上的空余间隙。另外,在检测过程中标本须先行稀释(1:40~1:200),以避免过高的阴性本底影响结果的判断。

加酶标抗体:使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也

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加底物:夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入

根据同样原理,将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物,即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故

双位点一步法

可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

在双抗体夹心法测定抗原时,如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体,则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作,缩短了反应时间,如应用高亲和力的单克隆抗体,测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

由于酶的催化频率很高,故可极大地地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度

图15-5双位点一步法示意图

类型及步骤

在一步法测定中,应注意钩状效应,类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成夹心复合物,所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

ELISA的主要常用类型及步骤

间接法测抗体

  1. 间接法测抗体

间接法是检测抗体最常用的方法,其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体,故称为间接法。操作步骤如下:

间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(二抗)以检测与固相抗原结合的

将特异性抗原与固相载体连接,形成固相抗原:洗涤除去未结合的抗原及杂质。

受检抗体,故称为间接法。操作步骤如下:

加稀释的受检血清:其中的特异抗体与抗原结合,形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合,在洗涤过程中被洗去。

1)将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原,洗涤除去未结合的抗原及杂质。

加酶标抗抗体:与固相复合物中的抗体结合,从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后,固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体,可用酶标羊抗人IgG抗体。

2)加稀释的样本,保温反应。样本中的特异抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗体复合物。

加底物显色:颜色深度代表标本中受检抗体的量。

经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体,样本中的其他成份在洗涤过程中被洗去。

本法只要更换不同的固相抗原,可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。

3)加酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合,从而间接地标记上酶。洗涤后

图15-6间接法测抗体示意图

,固相载体上的酶量与样本中受检抗体的量正相关。

竞争法

4)加底物显色。

竞争法可用于测定抗原,也可用于测定抗体。以测定抗原为例,受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合,因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下:

2.竞争法测抗原

将特异抗体与固相载体连接,形成固相抗体。洗涤。

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定

待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液,使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原,则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原,则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合,竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会,使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原,保温后,酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。

,可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标

加底物显色:参考管中由于结合的酶标抗原最多,故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差,代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡,表示标本中抗原含量越多。

本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅。小分子激素、药物

图15-7竞争法测抗原示意图

等ELISA测定多用此法。

捕获法测IgM抗体

如何选择合适的阳性对照?

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