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原标题:而另大器晚成组只加酶标志抗原,由于ELISA法一方

浏览次数:59 时间:2020-01-23

核心提示: 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞

ELISA试剂盒实验原理

核心提示:一、前言 近二十几年来,免疫学分析方法发展很快,特别是在使用一、前言 近二十几年来,免疫学分析方法发展很快,特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后,使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光和60年代的放射免疫分析技术之后,在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。由于酶的高效生物催化作用,一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应,产生了放大作用,使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来,这种技术被称为酶联免疫吸附试验法(Enzyme—LinkedImmunosorbentAssay,ELISA),本法自70年代初期由VANWEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相继分别报道后,现已引起广泛重视。 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术,现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定,根据已经使用的结果,认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查,而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此,也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体,而且也可用于测定体液中的循环抗原,所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大,可概括四个方面: 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。 二、方法的基本原理和种类 ELISA的基本原理有三条: 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性; 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性; 酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果。 由于ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上,因而,具有特异性。而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物,它可以催化底物分子发生反应,产生放大作用,正因为此种放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此,ELISA法是一种既敏感又特异的方法。常用的ELISA有以下两个方面。 测定抗原的,主要有四种方法。 1、竞争法(Competitionmethod):本法首先将特异性抗体吸附于固相载体表面,我们把抗原和抗体吸附到固相载体表面的这个过程,称为包被,也可叫做致敏。经洗涤后分成两组:一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液,而另一组只加酶标记抗原,再经孵育洗涤后加底物显色,这两组底物降解量之差,即为我们所要测定的未知抗原的量。 这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可,因此,对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。该法的优点是快,因为只有一个保温洗涤过程。但需用较多量的酶标记抗原为其缺点。2、双抗体夹心法 本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体,经洗涤后加入含有抗原之待测样品,如待检样品中有相应抗原存在,即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合,经保温孵育洗涤后,即可加入酶标记特异性抗体,再经孵育洗涤后,加底物显色进行测定,底物降解的量即为欲测抗原的量。这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位,因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用,而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此,不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。我们用在霍乱肠毒素的测定。HbSAg及HbS的测定。3、改良双抗体夹心法:本法是双抗体夹心法的一种改良形式,也是用于测定抗原的

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)原理

方法的基本原理可见下图:本法首先将特异性抗体吸附于固相载体表面,我们把抗原和抗体吸附到固相载体表面的这个过程,称为包被,也可叫做致敏。经洗涤后分成两组:一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液,而另一组只加酶标记抗原,再经孵育洗涤后加底物显色,这两组底物降解量之差,即为我们所要测定的未知抗原的量。

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent 

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assay,ELISA)用于IgG定量测定的文章,使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成

液体标本中微量物质的测定方法。

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗

体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定

时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使

固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也

通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入

酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故

可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

由于酶的催化频率很高,故可极大地地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度

类型及步骤

ELISA的主要常用类型及步骤

  1. 间接法测抗体

间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(二抗)以检测与固相抗原结合的

受检抗体,故称为间接法。操作步骤如下:

1)将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原,洗涤除去未结合的抗原及杂质。

2)加稀释的样本,保温反应。样本中的特异抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗体复合物。

经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体,样本中的其他成份在洗涤过程中被洗去。

3)加酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合,从而间接地标记上酶。洗涤后

,固相载体上的酶量与样本中受检抗体的量正相关。

4)加底物显色。

2.竞争法测抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定

,可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标

加拿大pc28,本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅。小分子激素、药物

等ELISA测定多用此法。

如何选择合适的阳性对照?

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